多囊肾病囊肿衬里上皮细胞细胞系的建立与鉴定
 
    　　　　　　　　　　　多囊肾病囊肿衬里上皮细胞细胞系的建立与鉴定
　　　　　　　　　　　　　高洪建 王成聚 王朝阳 王军英 韦玉芹
    关键词: 常染色体显性遗传多囊肾病；囊肿衬里上皮细胞；鉴定
　　摘　要　目的：建立人常染色体显性遗传型多囊肾病（ADPKD）囊肿衬里上皮细胞系。　方法：ADPKD囊肿衬里上皮细胞经FuGENE6介导转染pSV3质粒，并以G418筛选转染成功的细胞。转染后的第48代细胞予以光镜、电镜形态学观察，细胞生长率测定，细胞染色体检查，碱性磷酸酶染色及细胞角蛋白、波形蛋白等免疫组化检查。结果：第48代细胞的碱性磷酸酶染色及抗细胞角蛋白、波形蛋白单克隆抗体反应阳性；形态学特征，细胞生长率与未经转化的第2代细胞相比也无明显差异；但大部份转化细胞染色体为异倍体。　结论：经鉴定，ADPKD囊肿衬里上皮细胞系已建立，可用于ADPKD细胞及分子生物学的研究。
　ESTABLISHMENT AND IDENTIFICATION OF ADPKD CYST-LINING EPITHELIAL CELL LINES
XU Cenggang，MEI Changlin，ZHANG Liming
（Department of Nephrology，Changzheng Hospital，Second Military Medical University，Shanghai，200003）
OBJECTIVE To establish a cell lines of autosomal dominant polycystic kidney disease （ADPKD）cyst-lining epithelialium．METHODOLOGY FuGENE6 were used to transduce the pSV3 plasmid into cultured ADPKD cyst-lining epithelial cells．After transfection，cells were selected by addition of G418 to the culture medium in order to obtain successfully transfected cells．Passage 48 cells were utilized for the following studies：①cell morphology observation，②growth rate determination，③chromosome examination，④alkaline phosphatase staining and⑤immunocytochemical staining of cytokeratin and vimentin． RESULTS No significant difference in morphology and cell growth rate was found between passage 48 cells and passage 2 cells which were not transfected．The majority of the cells were polygonal，only a few were extremely elongate cells．Microvilli-like coating of cells and adhesion plaque at site of cell-cell contact were observed under transmission electron microscopy．Both passage 2 cells and passage 48 cells were positive for alkaline phosphatase staining、immunochemical staining of cytokeratin and vimentin，whereas the immunochemical staining of factor Ⅷ、actin、desmin and fibroblast specific protein were negative．Chromosome of most transformed cells were heteroploid． CONCLUSION An ADPKD cyst-lining epithelial cell line has been established and identified，which can be used in the research of ADPKD cellular and molecular mechanism．
Key words autosomal dominant polycystic kidney disease cyst-lining epithelial cell identification
　　常染色体显性遗传型多囊肾病（ADPKD）囊肿衬里上皮细胞在多囊肾病的发生、发展中起着重要作用。1986年，Wilson等［1］原代培养多囊肾病囊肿衬里上皮细胞获得成功，为多囊肾病发病机制的研究提供了细胞模型。但是，原代培养囊肿衬里上皮细胞比较困难，细胞生存期短，一般只能传4～5代，限制了研究工作的开展。因此有必要建立稳定的细胞系用于细胞信号转导、基因治疗等分子生物学研究。
    1　材料和方法
1．1　材料　胶原酶，D-Valine（左旋缬氨酸）改良的MEM培养基（Sigma公司）。胎牛血清，G418，RPMI-1640培养基（GibcoBRL公司）．pSV3质粒(美国华盛顿大学张鲁榕博士惠赠)。兔抗人角蛋白、结蛋白、波形蛋白、Ⅷ因子、成纤维细胞特异蛋白、肌动蛋白单克隆抗体（DAKO公司）。FuGENE转染试剂（Boehringer　Mannhein公司）。
1．2　方法
    1．2．1　原代细胞培养　多囊肾组织来自一例34岁女性患者。剪取浅表、透明的囊泡，剥离表层纤维膜，囊泡壁切成碎屑。经0.1％胶原酶37℃振荡水浴箱消化1h后，细胞接种于经鼠尾胶原包被的培养瓶中，置于5％CO2、37℃的孵箱内。培养液由20％胎牛血清、10 mmol／L Hepes、100 kU／L青霉素、100 kU／L链霉素及D-Valine改良的MEM组成。当细胞接近融合时，用0.25％胰蛋白酶与0.02％EDTA的等量混合液消化细胞进行传代。
    1．2．2　细胞转染　第二代细胞用于转染。转染前一天接种细胞于6孔培养板，每孔2×105细胞、2ml培养液。转染前用无血清培养液将6　μl　FuGENE6稀释到100μl，再用FuGENE6稀释液稀释1.5　μg　pSV3。然后将FuGENE6、pVS3混合液滴加入一个孔中。48h后，细胞按1∶10传代，并予培养。
    1．2．3　液中加入G418（600 mg／L），5天后G418浓度改为200 mg／L，每4～5天换液一次。待出现抗药克隆后，用RPMI1640代替培养液中的D-Valine改良的MEM扩增细胞。
    1．2．4　连续细胞系的鉴定
　　(1)倒置相差显微镜检查　以第二代衬里上皮细胞作对照，对第48代衬里上皮细胞进行鉴定。
　　(2)透射电镜检查　细胞经离心沉淀后，4℃ 2.5％的戊二醛固定1h，然后用二甲砷酸钠缓冲液冲洗3次，1％锇酸固定1h，0.1　mol／L　PBS冲洗3次，常规包埋，LKB超薄切片机切片，铅染，透射电镜下观察。
　　(3)免疫组化及细胞酶化学鉴定　48代衬里上皮细胞接种在置有盖玻片的6孔板中，80％融合时，取出玻片，丙酮固定10min，常规方法分别加入兔抗人细胞肌动蛋白、结蛋白、角蛋白、第Ⅷ因子、波形蛋白、成纤维细胞特异蛋白单克隆抗体。再加入生物素标记的抗兔IgG第二抗体。最后加卵白素-生物素-过氧化物酶（ABC）复合物及DAB溶液显色。阳性者呈棕黄色。细胞碱性磷酸酶染色时，上述盖玻片于4℃丙酮固定4min。37℃碱性磷酸酶孵浴液孵浴2h，蒸溜水洗后，先后加2％硝酸钙2min，2％硝酸钴2min，0.1％硫酸铵1min。最后用甲基绿复染细胞核。阳性者呈灰黑色。
　　(4)细胞染色体检查　50％～80％融合的细胞在终止培养前6h加入秋水仙碱（终浓度为0.4～0.8　mg／L）。继续培养4～6h，然后离心，低渗处理，预固定，固定制片，Giemsa染色。
　　(5)细胞生长率测定　将一定量的细胞平均接种于24孔培养板中，共15孔，于1、3、5、7天分别计数3个孔的细胞数，取其均值，以其对数标于半对数坐标纸上，画出细胞生长曲线。
　　(6)细胞系的冻存与复苏试验　第48代衬里上皮细胞接近融合时，传代，制备浓度为5×109／L的细胞悬液，加10％二甲基亚砜后冻存。过程为4℃冰箱2h，－20℃冰箱2h，－80℃冰箱过夜，然后直接投入液氮中。分别于1、3、6个月后复苏细胞，观察细胞复苏率。
    2　结　　果
    2．1　细胞培养　原代培养细胞贴壁慢，一旦贴壁后生长迅速，约一周左右长满瓶底。按1∶3比例传代的细胞约3～4天即生长融合。20天后细胞生长速度明显下降，30天后细胞基本处于生长停滞状态。
    2．2　细胞转化　经pSV3转染后48h的细胞置于含600 mg／L G418的培养液中，5天后细胞大部份死亡，G418浓度改为200 mg／L后，于第15天左右出现抗药克隆。
    2．3　细胞鉴定
    2．3．1　倒置相差显微镜观察　第2代细胞与第48代细胞形态无明显差别，大部份细胞呈多角形，呈旋涡状生长，旋涡中心细胞呈多角形，随着细胞数量增多，中心周围的细胞逐渐拉长呈梭形。这一现象在细胞生长接近融合时易见到。
    2．3．2　透射电镜检查　电镜可看到细胞核呈圆形或多角形，具1～2个核仁；细胞膜上覆盖有大量微绒毛；细胞间可见粘合斑（图1A、B）。
    2．3．3　免疫组化及细胞酶化学鉴定　衬里上皮细胞株抗细胞角蛋白、波形蛋白单抗阳性，抗第Ⅷ因子、细胞结蛋白、肌动蛋白、成纤维细胞特异蛋白单抗阴性。碱性磷酸酶染色呈灰黑色阳性反应。

Fig．1． Transmission electron micrographs of cultured cyst-lining epithelial cells
（A）microvilli-like coating of cells；（B）adhesion plaque at site of cell-cell contact ×9600．
    2．3．4　细胞染色体检查　染色体检查发现染色体大多呈异倍体(图2)。